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檢測范圍：7.8 ng/ml-500 ng/ml

最低檢測限：1.95 ng/ml

特異性：本試劑盒可用于快速檢測環丙沙星。有一定交叉反應。

交叉反應： 環丙沙星100%

           諾氟沙星150%

           氧氟沙星100%

           沙拉沙星130%

          恩諾沙星86%

有效期：6個月

預期應用：ELISA法定量測定牛奶、牛肉、豬肉、羊肉、雞、火雞、魚和蝦中的環丙沙星殘留量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。

概述

回旋酶抑制劑分為四種亞群，恩諾沙星（代謝產物：環丙沙星）和達氟沙星屬于氟奎諾酮，是允許使用的獸用藥物。氟奎諾酮是廣譜抗菌素，廣泛應用養殖業，特別是牛、豬和雞。在過去的幾年里，氟奎諾酮的使用有所增加，大量的奎諾酮類藥物被用于預防傳染病，特別是在雞、豬和魚/蝦養殖廠。

實驗原理

本試劑盒采用免疫競爭法檢測環丙沙星。微孔板上包被有抗環丙沙星抗體。加入環丙沙星酶結合物和環丙沙星標準品或樣品，游離環丙沙星與環丙沙星結合物競爭微量反應板上的抗環丙沙星抗體，沒有結合的酶結合物被洗去。再向反應孔中加入相應反應底物TMB，作用一定時間后，結合的酶結合物將TMB轉化為藍色，轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環丙沙星呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         已包被兔抗三聚氰胺抗體的酶聯板(Assay plate )：一塊（96孔）。

2.         標準品（Standard）：2×100ul/瓶。

3.         樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4.         辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物（HRP - CPFX）：1×100ul/瓶（1：100）。

5.         辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物稀釋液（HRP –CPFX Diluent）：1×10ml/瓶。

6.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

7.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

8.         終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要的試劑和器材

1.         標準規格酶標儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養箱

4.         超聲清洗器

5.         離子交換小柱（PCX）

6.         氮氣吹干儀

7.         干凈的試管和Eppendof管

8.         系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器

9.         蒸餾水，容量瓶等

樣品制備：

牛奶不需要處理；肉、魚、蝦等需均質、提取、離心、稀釋。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶濃度為500 ng/ml，以樣品稀釋液做系列倍比稀釋，分別稀釋500 ng/ml，250 ng/ml， 125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml。

辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔50ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物加990ul辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

操作步驟

實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘-1小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

3.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

4.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

5.         用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、辣根過氧化物酶標記環丙沙星結合物工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。

5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

9. 本產品適用于大量樣本的快速篩查。由于生物試驗存在人為及不可預知的影響因素，本試劑盒得到的檢測結果僅為參考，不能據此做出任何結論。

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